什么是熔解曲线技术

熔解曲线技术利用不同的双链 DNA 具有不同的解链温度 (Tm) ，通过染料或者探针监测熔解曲线形态变化，从而快速准确地进行基因分型和微生物鉴定。
 

近年来熔解曲线技术，不仅可以区分 Tm 值差异大的 PCR 扩增产物，还可以区分 Tm 值差异极小的产物，甚至是单碱基差异的产物，故被广泛用于未知突变的筛查、已知突变的检测及基因分型、微生物的分型与鉴定、DNA 甲基化检测等领城。
 

为什么要进行熔解曲线分析

实时 PCR 所面临的挑战是如何增加单次反应所能检测或识别的不同靶序列的数目或者同一靶序列的多位点组成信息，熔解曲线分析技术即完美解决这一问题，实现实时 PCR 多靶同时检测的方式是利用不同荧光通道的 Tm 多重检测。
 

在溶剂固定的前提下，双链 DNA 的 Tm 值是固定不变的。利用双链 DNA 这个特性，在实时 PCR 之后进行熔解曲线分析，就可以检测双链 DNA 的 Tm 值，根据 Tm 值的差异就可以对不同的扩增产物或靶序列进行区分。
 

熔解曲线形成原理

在 qPCR 反应结束后，对该反应体系进行升温，双链 DNA 在加温过程中逐渐解链，结合的染料逐渐析出，荧光强度也随之下降。当加热温度达到双链 DNA 的退火温度（Tm 值）时，在此温度下，已经解链一半的双链 DNA，迅速解链，荧光信号骤降，形成荧光信号曲线上变化的拐点。对荧光信号曲线进行负一阶求导，就得到熔解曲线图，熔解曲线峰值对应的 X 轴的温度，就是双链 DNA 的 Tm 值。
 

​图 1. 熔解曲线形成原理
 

染料法在方便快捷的同时不具有特异性，能与所有双链 DNA 结合（如染料法图所示），即便是在高分辨率熔解曲线，同样不能定位基因突变的具体位置。为了满足精确定位的的需求，探针熔解曲线技术正在飞速发展，该技术利用荧光探针代替染料与目的基因相结合，分析探针与目的片段的解链温度，即可达到基因分型的目的。另外，探针可选择不同波长的荧光标记，充分利用荧光 PCR 仪的多个通道，实现多基因多位点的并行性检测。例如，宏微特斯的 EMPA 技术以及韩国 Seegene 公司的 TOCE 技术等。

 

图 2. SYBR Green 染料法

图 3. 宏微特斯自主研发的 EPMA 技术

图 4. TOCE™ Technology(韩国) 

熔解曲线的优势

在同一 PCR 反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型；多重 PCR 很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道病毒、性病、呼吸道病毒等的同时检测；多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大节省时间、节省试剂、节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。