Nature Medicine : 利用宏基因组测序技术快速检测人类体液样本中的病原体

2020 年 11 月，美国加利福尼亚大学 Charles Y. Chiu 教授团队，发表在《Nature Medicine》（IF：36.13）上的一篇研究「Rapid pathogen detection by metagenomic next-generation sequencing of infected body fluids」^[1]，介绍了基于宏基因组测序技术，利用人类体液游离 DNA，快速诊断病原体的方法。该方法适用于 illumina 和 Nanopore 测序平台。

 

 

摘要
 

作者利用体液中的游离 DNA 进行了 mNGS 测序，以鉴定病原体。实验收集 160 名急性病患者的 182 种体液，分别在 illumina 和 nanopore 两种测序平台进行测序，并利用培养物、16S 细菌 PCR 和/或 28S-内部转录核糖体基因间隔子（28S-ITS）真菌 PCR 的微生物学测试，进行检测性能对比。结果显示，Illumina 测序得到细菌的检测灵敏度和特异性分别为 79% 和 91%，真菌为 91% 和 89%；而 nanopore 测序中，细菌分别为 75% 和 81%，真菌为 91% 和 100%。在 12 例培养/ PCR 阴性体液但最终被确诊为感染的患者中，有 7 例（58%）是 mNGS 阳性。Nanopore 测序可在 50 分钟内检测到病原体，6 小时 sample-to-answer 周期内完成病原体鉴定。快速的 mNGS 检测是未知感染源诊断领域，非常有潜力的工具。

 

背景
 

对于严重感染的患者，在临床干预和靶向使用抗生素时，病原诊断变得至关重要。然而实际情况中，及时准确的诊断仍然是一个巨大的挑战。当前实验室检测主要分为两类，一种是通过培养观察病毒，真菌或者细菌是否会繁殖，另一种是通过 PCR 技术来识别外来病原体是否存在。这些手段的缺陷明显，如培养耗时较长，PCR 只适用于临床医生已经确定了感染性质的情况。
 

宏基因组测序技术对病原学检测具有无偏移、全覆盖、高效率等优势，越来越多的学者尝试将其应用于临床病原诊断之中。本研究开发了一种简单快速通用的检测方法，基于 cfDNA 的 mNGS 测序，双 barcode 系统适用于 Illumina 和 Nanopore 两种平台，可以检测不同类型的体液中的病原体。

 

研究方法
 

研究人员从 160 名患者中采集了多种体液样本 182 份，包括脓肿、胸腔积液和脑脊液。其中，127 个样本在培养中呈阳性，9 个样本在培养中呈阴性但 PCR 呈阳性，以及 34 个阴性对照。利用自主开发的 dual-use barcode 建库系统，在 Illumina 和 Nanopore 平台进行 mNGS 测序，数据采用自研的 SURPI+分析软件，将病毒比对到 NT 库，细菌、真菌和寄生虫比对到 RefSeq 库，并将该方法与传统的微生物培养和 PCR 技术进行了效能比较。

 

研究结果
 

1、体液和血浆病原体 DNA 含量比较
 

来自同一患者的血浆与体液样本，利用 mNGS 检测，基于 nRPM 统计结果显示，体液样本病原体 cfDNA 检测量比血浆高出 160 倍。
 

图 1. 体液和血浆病原体 DNA 含量比较

2、mNGS 与 PCR 检测性能比较
 

通过 mNGS 和 16S(bacterial) 和 28S–ITS(fungal) PCR 对培养阴性的 14 份样本进行检测，结果如下韦恩图所示，14 份样本中有 8 份 mNGS 与聚合酶链式反应（PCR）检测结果一致，5 份仅通过 mNGS 检出，1 份仅 PCR 检出。中图展示了两种方法的阳性预测率和阴性预测率，PCR 检测的 PPA 为 64%，NPA 为 93%。而 mNGS 分别为 86% 和 100%，检测性能优于 PCR。

图 2. mNGS 与 PCR 性能比较

3、 Illumina 与 Nanopore 检测性能比较
 

随机抽取 43 份临床样本作为训练集，127 份样本为验证集，用于 illumina 测序；随机抽取 42 份临床样本作为训练集，43 份为验证机，用于 nanopore 测序。结果如下图 ROC 曲线所示，illumina 的 AUC 值分别为 0.876 和 0.885，nanopore 分别为 0.864 和 0.877，illumina 检测性能略优于 nanopore。

图 3. Illumina 与 Nanopore 检测性能比较
 

对于不同类型病原的检测比较如图 3 c，Illumina 测序检测细菌的 PPA 为 79.2%，NPA 为 90.6%；Nanopore 检测结果分别为 75% 和 81.4%；Illumina 测序检测真菌的 PPA 为 90.6%，NPA 为 89%，而 Nanopore 检测结果为 90.9% 和 100%。Illumina 检测细菌方面较优，而 nanopore 在检测真菌时效果更好。

4、检测周期
 

如下图所示，微生物培养需要 24 h 到 4 周的时间，illumina mNGS 方法需要 23 h，而 nanopore mNGS 方法只需要 5-7 h 就可以得出结果。

图 4. 检测周期

 

总结
 

研究团队开发了一种从体液 cfDNA 中快速鉴定病原体的方法，使得 mNGS 成为临床未知感染诊断领域中颇具潜力的工具。本文主要创新点：

1、可检测广泛的样本类型
2、可检测 DNA 含量 100 pg ml–1–100 ug ml–1
3、dual-use barcoding 系统可用于 illumina 和 nanopore 平台
4、mNGS 自动化分析和解读流程

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参考文献：

[1] Gu W ,  Deng X ,  Lee M , et al. Rapid pathogen detection by metagenomic next-generation sequencing of infected body fluids[J]. Nat Med. 2021 Jan; 27(1):115-124.